Estudo imonoquimico do veneno da largata lonomia obliqua e desenvolvimento de um ELISA ("enzyme-linked immunosorbent assay") para detecção do veneno

O envenenamento humano por lagartas de mariposas saturnídeas L. obliqua, leva a distúrbios hemostáticos, sendo o óbito, em geral, decorrente de insuficiência renal aguda ou de hemorragia maciça em órgãos nobres. Pouco se sabe sobre a composição bioquímica e imunológica do veneno destas lagartas. Esta dissertação descreve um estudo imunológico do veneno desta espécie, incluindo o desenvolvimento de um "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay" (ELISA) para detecção do veneno de L. obliqua. As imunoreatividades do extrato de cerdas, hemolinfa e saliva de L. obliqua frente ao soro anti-Lonomia foram comparadas por imunodifusão de Ouchterlony, imunoeletroforese e imunoblot após SDS-PAGE. A reatividade do antiveneno com outros venenos animais também foi investigada. Na imunodifusão, o extrato de cerdas e hemolinfa mostraram várias linhas de imunoprecipitação, algumas das quais com completa identidade. A hemolinfa de L. achelous também reagiu com o antiveneno, mas em menor extensão, e mostrou algumas linhas de identidade parcial com a hemolinfa de L. obliqua. Com exceção do extrato de cerdas e hemolinfa da lagarta da mariposa saturnidea A. rectilínea, que mostrou fracas linhas de imunoprecipitação de não-identídade com o extrato de cerdas e hemolinfa de L. obliqua, não houve reação entre o soro mti-Lonomia e outros venenos animais testados. A imunoeletroforese essencialmente confirmou a imunoreatividade observada na imunodifusão. O Imunoblot mostrou que o perfil do extrato de cerdas foi semelhante ao da hemolinfa, particularmente na região de 45-205 kDa. O extrato de cerdas de A. rectilínea e as hemolinfas de A. rectilínea e L. achelous mostraram várias bandas semelhantes àquelas vistas com cerdas e hemolinfa de L. obliqua. Não houve reatividade com as salivas de A. rectilínea e L. obliqua nestes ensaios. Houve uma reatividade muito fraca (não específica) com os venenos de P. nigriventer e T. serrulatus, mas não ocorreu reatividade com venenos de serpentes. Para o ELISA, placas multi-poço foram sensibilizadas com soro anti-L. Obliqua (1:1000) "ovemight", lavadas e incubadas com extrato de cerdas, hemolinfa, saliva ou outros venenos animais. Após lavagem e incubação com IgG purificada por afinidade e conjugada à peroxidase (1:800), o substrato (oenilenodiamina) foi adicionado e a absorbância lida a 492 nm, após 30 min. Em alguns experimentos, o extrato de cerdas, hemolinfa e saliva de L. obliqua foram fracionados por gel filtração em Superdex 75,equilibrada com tampão Tris-HCl 0,1 M5 pH 7,8 e a imunoreatividade das frações foi testada pelo ELISA. A detecção limite para o extrato de cerdas no ELISA foi 0,5 - 1,0 ng/poço (5-10 &#956;g/ml) com resposta máxima com >2 &#956;g/poço (20 &#956;g/ml). O coeficiente de variação íntra- ensaio foi <5%. A hemolinfa de L. obliqua mostrou imunoreatividade quase idêntica à do extrato de cerdas. No entanto, a saliva não mostrou reatividade. Houve moderada reatividade cruzada com a hemolinfa de L. achelow e baixa reatividade cruzada com a hemolinfa e extrato de cerdas da lagarta saturnídea A. rectilínea. Não ocorreu reatividade cruzada com venenos de serpentes, aranha e escorpião em concentrações de até 100 Hg/poço. A cromatografia de gel filtração em Superdex 75 mostrou que o extrato de cerdas e hemolinfa de L. obliqua possuem perfis de eluição muito semelhantes a 280 nm e imunoreatividade similar no ELISA. Ambos diferem marcadamente do perfil de eluição e imunoreatividade da saliva. A administração i.v. do extrato de cerdas de L. obliqua em ratos (400 &#956;g/kg) mostrou rápido declínio nos níveis circulantes de antígenos nas primeiras 2 h, seguido por diminuição progressiva até as 16 h quando tomaram-se não detectáveis. Quando a mesma dose foi injetada s.c, houve variação considerável nos níveis séricos de antígenos com picos observados em 0,5,4 e 16 h após a injeção. O perfil cinético obtido com a administração i.d. foi semelhante àquele visto com a injeção i.v., embora os níveis absolutos de antígenos tenham sido muito menores. Estes resultados mostram que há pouca ou nenhuma reatividade cruzada entre o soro anti-£. obliqua e venenos animais não saturnídeos. As semelhanças de imunoreatividades do extrato de cerdas e hemolinfa sugerem que o veneno pode ser derivado da hemolinfa e que esta poderia ser uma fonte útil e mais acessível para a purificação de fatores que afetam a cascata de coagulação. A sensibilidade e a especificidade do ELISA desenvolvido pode ser útil para imunodiagnóstico na clínica, embora o tempo após o envenenamento e a quantidade de veneno injetado possam ser um dos fatores limitantes na detecção de antígenos circulantes, como mostrado pelos experimentos cinéticos em ratos.Human envenoming by caterpillars of the saturnid moth Lonomia obliqua in southern Brazil leads to hemostatic disturbances and hemorrhage, with death resulting from acute renal failure or intracranial hemorrhage. Little is known of the biochemical and immunological composition of the venom of these caterpillars. This thesis describes an immunological study of the venom of this species, including the development of an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of L. obliqua venom. The immunoreactivities of L. obliqua spicule extract, hemolymph and saliva with antiserum to L. obliqua venom were compared by Ouchterlony immunodiffusion, Immunoelectrophoresis and immunoblotting following SDS-PAGE. The reactivity of the antivenom with other animal venoms was also assessed, In immunodiffusion, the spicule extract and hemolymph showed several immunoprecipitin lines, some of which had complete identity. Hemolymph from the related L. achelous also reacted with the antivenom, but to a lesser extent, and showed some lines of partial identity with L. obliqua hemolymph. Except for a spicule extract and hemolymph from the saturnid moth Automeris rectilinea which showed weak immunoprecipitin lines of non-identity with L. obliqua spicule extract and hemolymph, there was no reaction between L. obliqua antiserum and the other animal venoms tested. Immunoelectrophoresis essentially confirmed the immunoreactivities observed with immunodiffusion. Immunoblotting showed that the profile of the spicule extract was similar to that of hemolymph, particularly in the region of 45-205 kDa. A spicule extract from A. rectilinea and hemolymph from A. rectilinea and L. achelous showed several bands similar to those seen with L. obliqua spicules and hemolymph. There was no reactivity with A. rectilinear or L. obliqua saliva in these assays. There was very low (non-specific) reactivity with P. nigriventer and T. serrulatus venoms but no reactivity with snake venoms. For the ELISA, multiwell plates were coated overnight with antivenom to L. oblique venom (1:1000) and then washed and incubated with spicule extract, hemolymph, saliva or other animal venoms. After washing and incubation with affinity-purified IgG conjugated to peroxidase (1:800), substrate (o-phenylenediamine) was added and the absorbance read at 492 nm after 30 min. In some experiments, L. obliqua spicule extract, hemolymph and saliva were fractionated by gel filtration on Superdex 75 equilibrated with 0.1 M Tris-HCl, pH 7.8 and the immunoreactivity of the fractions was tested by ELISA. The detection limit for spicule extract in the ELISA was 0.5-1.0 ng/well (5-10&#956;g/ml) with a maximum response at > 2 &#956;g/well (20 &#956;g/ml). The intra-assay coefficient of variation was